Вместе эти гистонные модификации составляют то, что известно как гистонный код, который диктует транскрипционное состояние местной геномической области.Исследование гистонных модификаций в определенной области, или по всему геному, может выявить состояния активации генов, местоположения промоторов, усилителей и других элементов регулирования генов.

Подробные изменения гистона
 

Ацетилирование

Ацетиляция является одной из наиболее широко изученных модификаций гистона, поскольку она была одной из первых обнаруженных, влияющих на регуляцию транскрипции.Немодифицированные остатки лизина положительно заряжены, но ацетилирование приводит к нейтрализации заряда на гистонах, что уменьшает взаимодействие гистонов и отрицательно заряженной ДНК. Нейтрализация заряда приводит к более слабому гистону:позволяет связываться с фактором транскрипции и значительно увеличивает экспрессию генов (Roth et al.., 2001).

Ацетиляция гистона участвует в регуляции клеточного цикла, пролиферации клеток и апоптоза и может играть жизненно важную роль в регулировании многих других клеточных процессов, включая клеточную дифференциацию,Репликация и восстановление ДНКДисбаланс в равновесии ацетилирования гистонов связан с опухолеобразованием и прогрессированием рака.

Регулирование ферментами

Ацетилные группы добавляются к лизинным остаткам гистонов H3 и H4 гистоно-ацетилтрансферазами (HAT) и удаляются деацетилазами (HDAC).известный как промотор-локализованное ацетилированиеНапример, ацетилирование К9 и К27 на гистон H3 (H3K9ac и H3K27ac) обычно связано с усилителями и промоторами активных генов.Низкий уровень глобальной ацетилации также обнаружен во всех транскрибированных генах., чья функция остается неясной.

Метилирование

Метилирование добавляется к лизиновым или аргининовым остаткам гистонов H3 и H4, с различным воздействием на транскрипцию.и др.., 2012) в то время как метилирование лизина связано как с транскрипционной активацией, так и с репрессией в зависимости от места метилирования.Эта гибкость может быть объяснена тем, что метилирование не изменяет гистонный заряд или непосредственно влияет на взаимодействие гистон-ДНК., в отличие от ацетилирования.

Лизины могут быть моно-, ди- или триметилированными, обеспечивая дополнительное функциональное разнообразие для каждого места метилирования.как моно- так и триметилирование на К4 гистона H3 (H3K4me1 и H3K4me3) являются маркерами активации, но с уникальными нюансами: H3K4me1 обычно маркирует транскрипционные усилители, в то время как H3K4me3 маркирует промоторы генов.триметилирование К36 (H3K36me3) является маркером активации, связанным с транскрибированными областями в геновых телах.

Напротив, триметилирование на K9 и K27 гистона H3 (H3K9me3 и H3K27me3) являются репрессивными сигналами с уникальными функциями:H3K27me3 - это временный сигнал в областях промотора, который контролирует регуляторы развития в эмбриональных стволовых клеткахВ то же время H3K9me3 является постоянным сигналом для образования гетерохроматина в хромосомных областях с бедными генами с тандемальными повторяющимися структурами, такими как повторяющиеся спутники,теломеры, и перицентромеры. Он также маркирует ретротранспозоны и специфические семейства генов цинкового пальца (KRAB-ZFP).с H3K27me3 в межгенных и заглушенных кодирующих областях и H3K9me3 преимущественно в кодирующих областях активных генов.

Регулирование ферментами

Метилирование гистонов - это стабильный признак, распространяющийся через множество клеточных делений, и в течение многих лет считалось необратимым.Недавно было обнаружено, что это активно регулируемый и обратимый процесс.

Метилирование: гистонные метилтрансферазы (HMT)

• Лизин

Содержащие домен SET (гистоновые хвосты)

Не содержащие SET-домен (гистоновые ядра)

• Аргинин

Семейство PRMT (белковые аргининометилтрансферазы)

Деметилирование: гистонные деметилазы

• Лизин

KDM1/LSD1 (лизиноспецифическая деметилаза 1)

JmjC (содержит домен Jumonji)

• Аргинин

PAD4/PADI4

Фосфорилирование

Фосфорилирование гистонов является важным промежуточным этапом в конденсации хромосом во время деления клеток, транскрипционной регуляции и восстановления повреждений ДНК (Rossetto et al., 2012, Kschonsak et al.,2015 г.)В отличие от ацетилирования и метилирования, фосфорилирование гистонов устанавливает взаимодействие между другими модификациями гистонов и служит платформой для эффекторных белков.что приводит к каскаду событий вниз по течению.

Фосфорилирование происходит на всех основных гистонах, с дифференциальным воздействием на каждого.участвуют в уплотнении хроматина и регуляции структуры и функции хроматина во время митозаЭто важные маркеры клеточного цикла и роста клеток, которые сохраняются во всех эукариотах.Фосфорилирование H2AX в S139 (в результате чего возникает γH2AX) служит точкой набора белков для восстановления повреждений ДНК (Lowndes et al.., 2005, Пинто и др., 2010) и является одним из самых ранних событий, происходящих после разрыва двойной нити ДНК.Фосфорилирование H2B не так хорошо изучено, но было обнаружено, что оно облегчает конденсацию хроматина, связанную с апоптозом., фрагментация ДНК и гибель клеток (Füllgrabe et al., 2010).

Убикитилирование

Все белки гистонового ядра могут быть повсеместно цитируемыми, но H2A и H2B являются наиболее распространенными и являются двумя из наиболее широко цитируемых белков в ядре (Cao et al., 2012).Убиквитилация гистонов играет центральную роль в реакции на повреждение ДНК.

Монобикитилирование гистонов H2A, H2B и H2AX встречается в местах разрыва двойных нитей ДНК. Наиболее распространенными формами являются монобикитилированные H2A на K119 и H2B на K123 (кваша) / K120 (позвоночные).Монобиквитилированный H2A также связан с глушением генов., тогда как H2B также ассоциируется с активацией транскрипции.

Полиубикитилирование встречается реже, но также важно для восстановления ДНК. Полиубикитилирование H2A и H2AX на K63 обеспечивает распознавание белков для восстановления ДНК, таких как RAP80.

Регулирование ферментами

Как и другие модификации гистонов, монобиквиталяция H2A и H2B обратима и строго регулируется гистонными лигазами убиквитина и деубиквиталирующими ферментами.

Монубикитилация

• H2A: белки группы поликомба
• H2B: Bre1 (квас) и его гомологи RNF20/RNF40 (самокров)

Полиубикитилация

• H2A/H2AX K63: RNF8/RNF168
   

Быстрый справочник по изменениям гистонов

Таблица 1 - таблица с наиболее распространенными изменениями и изменениями гистонаГде их найти:

Изучение гистонных модификаций с помощью CHIP

CHIP использует антитела для выделения белка или модификации, вместе с ДНК, к которой он связан (рисунок 5).Затем ДНК секвенируется и отображается в геноме, чтобы определить местоположение и количество белка или модификации..

Рисунок 2: Хистономодификация CHIP

Иммунопреципитация и очистка ДНК позволяют изолировать и идентифицировать геномические области, которые занимают модификации.

Использование антител против специфических гистонов и гистоновых модификаций в экспериментах с CHIP может выявить специфические места гистонов.

• Структуры хроматина более высокого порядка, например, H3K9me3 маркировки гетерохроматина и спутниковые повторения
• Активные или заглушенные гены и генетические программы, например, AH3K9ac отмечает активацию генов
• Генетические элементы, такие как промоторы и усилители, например H3K27me3 отмечает промоторы в богатых генами регионах, H3K4me1 отмечает активные усилители

Если функция модификации гистона известна, CHIP может идентифицировать конкретные гены и области с этой подписью модификации гистона и соответствующую функцию по всему геному.Эти гены и области затем могут быть дополнительно изучены на предмет их роли в биологическом процессе интересаИспользование ChIP против H3K4me1, например, позволит выявить местоположение и последовательность активных усилителей по всему геному, указывая на гены и генетические программы, представляющие интерес.

В качестве альтернативы, если функция гистонной модификации неизвестна, CHIP может идентифицировать последовательности, гены и местоположения с этой подписью,который затем может быть использован для вывода функции модификацииЭтот метод играл ключевую роль в декодировании большинства гистонного кода и по-прежнему ценен для определения функции недавно обнаруженных модификаций, таких как убиквитилация и другие новые маркировки.

Энзимы, модифицирующие гистоны: писатели и стиратели
- Что?

Гистонные модификации динамически добавляются и удаляются из гистонных белков специальными ферментами (таблица 2). Баланс между этими писателями и стиральщиками диктует, какие знаки присутствуют на гистонах.,и на каких уровнях, чтобы в конечном итоге контролировать, включаются или выключаются конкретные генетические программы и клеточные процессы, которые они организуют.

Таблица 2. Основные категории гистоновых записывателей и стиральщиков:

Выявление путей модификации и конкретных авторов и стирателей может выявить:

• Соответствующие клеточные пути, генетические программы и физиологические эффекты для дальнейшего исследования.Например, гистонные деацетилазы (HDAC) активируют пути иммунного развития, в то время как гистонные ацетилтрансферазы (HAT) играют решающую роль в дифференциации и пролиферации.
• Дисбаланс между писателями и стиральщиками, которые изменяют генетическое программирование и лежат в основе болезненных процессов.Характеристика таких дисбалансов и специфических ферментов может дать представление о патологии заболеваний, от рака до аутоиммунных заболеваний.
• Новые цели лекарств и терапевтические стратегии.После выявления дисбаланса могут быть разработаны препараты, влияющие на активность этих ферментов и исправляющие дисбаланс.предлагая новые терапевтические стратегии против заболеваний, которые до сих пор избегали медицинских усилийНапример, многие ингибиторы HDAC находятся в разработке как новые препараты против рака и воспалительных заболеваний, таких как артрит и диабет I типа.

Для усилий по разработке лекарств соединения могут быть легко просмотрены на предмет их влияния на активность писателя и стиральщика.

Характеризующие пути метилирования гистонов

В целом, анализ гистонометилтрансферазы (HMT) сложен в разработке, и большинство из них имеет несколько недостатков из-за конструкции анализа.3H-SAM как метиловый донор и S-аденозилгомоцистеин (SAH) как общий побочный продукт реакции метилирования.

• Управление радиоактивным материалом
• Высокая чувствительность к преодолению низкой k_кошка(оборот обычно < 1 мин-1) и K_Мзначения для метилдонора, SAM
• Предварительная очистка ферментно-белковых комплексов для оценки активности специфических HMTs

Анализы активности HMT Abcam преодолевают эти трудности, оценивая активность специфических HMT с антителами, которые обнаруживают специфический метилированный продукт, обеспечивая:

• Легкое колориметрическое или флюорометрическое обнаружение без радиоактивности
• Совместимость с ядерными экстрактами или очищенными белками (анализ специфичен для исследуемой модификации)
• Данные за 3 часа

Характеристика активности деметилазы

Анализы активности гистондеметилазы обычно измеряют образование формальдегида, побочного продукта деметилирования.тиолевые группы и ряд ионовПохожие на метолизационные анализы, эти анализы не являются специфическими для какой-либо деметилазы и могут проводиться только с очищенным белком.

Анализ гистон-деметилазы Abcam® позволяет обойти эти вопросы, непосредственно измеряя образование деметилированного продукта, обеспечивая:

• Повышенная чувствительность (20-1000-кратная) по сравнению с формальдегидом
• Более точные данные без вмешательства тиолов, моющих средств или ионов
• Совместимость с ядерными экстрактами или очищенными белками (из-за специфики анализа для изменения интереса)
• Измеряет активность деметилазы у широкого спектра видов, включая клетки/ткани млекопитающих, растения и бактерии
• Быстрый формат микропластинки с простыми цветометрическими или флюорометрическими показаниями
• Данные за 3 часа

Характеризующие пути ацетилирования гистонов

Abcam предлагает наборы для анализа общей, а также H4-специфической активности HAT. Эти анализы измеряют HAT-катализированную передачу ацетилгрупп от донора Ацетил-КоА к гистонным пептидам,который генерирует ацетилированный пептид и CoA-SHЗатем побочный продукт CoA-SH измеряется колориметрическими или флюорометрическими методами:

• Колориметрические анализы - CoA-SH служит важным коэнзимом для производства NADH, который вступает в реакцию с растворимым тетразолиевым красителем для получения продукта, который может быть обнаружен спектрофотометрически.Этот анализ идеально подходит для кинетических исследований., с непрерывным обнаружением.
• Флюорометрические анализы - CoA-SH реагирует с разработчиком и зондом для получения продукта, который обнаруживается флюорометрически.

Характеристика активности гистоновых деацетилаз

HDAC-белки подразделяются на четыре основные группы (класс I, класс IIA, класс IIB, класс III, класс IV) на основе функции и сходства последовательности ДНК.и IIB считаются "классическими" HDAC, деятельность которых ингибируется трихостатином А (TSA)., в то время как класс III - это семейство NAD+Класс IV считается атипичным классом самостоятельно, основанным исключительно на сходстве последовательности ДНК с другими.

Каждый из этих классов связан с различными клеточными программами и может быть проанализирован индивидуально с помощью различных флюорометрических анализов.SIRT обычно связаны с раком и неврологическими заболеваниямиВыявление активности SIRT или выявление препаратов, влияющих на активность SIRT, может указывать на новые диагностические или терапевтические стратегии для этих заболеваний.

Флюорометрические анализы используют ацетилированный пептидный субстрат с флюорофором и гасителем на его амино- и карбоксиловых терминалах.освобождение фторфора из гасителяПоследующее увеличение интенсивности флуоресценции фторфора прямо пропорционально активности деацетилазы.

Ингибирующие писатели и стиральщики

Это может быть полезно для ингибирования этих модифицирующих ферментов с использованием небольших молекул, а затем оценить последствия вниз по течению, чтобы исследовать участие и биологические функции гистонных модификаций.Ингибиторы писателей и стиральные средства являются жизненно важными инструментами для понимания роли эпигенетических модификационных путейОни также имеют важное значение для проверки целевых показателей "употребления наркотиков" в контексте доклинических исследований как в академическом, так и в промышленном контекстах.

Читатели/переводчики для модификации гистонов

Гистонные модификации регулируют физические свойства хроматина и его соответствующее транскрипционное состояние.либо напрямую (например, ацетил-группы, которые отталкивают отрицательно заряженную ДНК для создания открытой хроматиновой конформации), либо через белковые адапторы, называемые эффекторамиЭффекторные белки распознают и связываются со специфическими эпигенетическими признаками, а затем набирают молекулярные механизмы для изменения структуры хроматина.Эти эпигенетические считыватели определяют функциональные результаты модификаций гистонов, переводив гистоновый код в действие.

Домены эффектора распознают специфические модификации гистона

Эффекторные белки распознают и связываются с признаками модификации гистонов через эффекторные домены, известные как модули (таблица 3).

Эти модули распознают специфические модификации гистона с аминокислотами, которые выстилают модуль ь связывающий карман.остатки за пределами этого связующего ящика (особенно в позициях N+2 и N-2) диктуют специфику модифицируемого остатка гистона и аминокислот (например, H3K4 против H4K20).

Небольшие различия в остатках внутри или снаружи связывающего ящика позволяют распознавать похожие эпигенетические признаки.или состояния триметилирования с незначительными изменениями структуры модуля метилсвязиНапример, домены тудора могут связываться исключительно с ди- или триметилированными лизинами, в то время как модули пальца PHD могут связываться с обоими или только с немодифицированными лизинами (Ruthenburg et al., 2007).

Мультивалентность позволяет усложнять код гистона

В одном и том же белке и/или белковом комплексе часто встречаются несколько модулей, связывающих гистон, которые позволяют распознавать специфические комбинации модификаций гистона.Это позволяет создать более сложный гистоновый код, где гистонные модификации взаимодействуют друг с другом, а не интерпретируются в изоляции.

Многовалентное взаимодействие гистонных модификаций важно для распознавания дискретных моделей маркировки со сложной специфичностью и повышенным сродством.в то же время, позволяя разнообразные и точные действия в дальнейшемНапример, один эпигенетический признак (например, H3K4me3) может активировать транскрипцию генов в одном контексте, но подавлять ее в другом, в зависимости от окружающих признаков.В таблице 4 приведены примеры некоторых функциональных ассоциаций различных комбинаций гистонных модификаций (Ruthenburg et al.., 2007).

Таблица 4. Функциональные ассоциации сосуществующих модификаций гистона и ДНК:

Многочисленные эффекторные модули в белке или комплексе могут взаимодействовать с модификациями гистона на тех же гистонах и/или нуклеосомах или между ними.

Внутринуклеосома:связываются с одной и той же нуклеосомой

• Цис-гистон: связывающийся с тем же гистонным хвостом
• Трансгистон: связывающийся с различными гистонными хвостами

Межнуклеосомальные:связываются с различными нуклеосомами

• Прилегающее соединение: связывание с прилегающими нуклеосомами
• Дисконтинентное соединение: связывание с несоседствующими нуклеосомами

Ссылки

Барски, А., Куддапа, С., Куй, К., Ро, Т.Ю., Шонс, Д.Э., Ван, З., Вэй, Г., Чепелев, И. и Чжао, К. Профилирование гистонных метилирований в геноме человека с высоким разрешением.823-837 (2007).

Цао, Дж. и Ян, К. Убиквитинация и девивиквитинация гистона в транскрипции, реакции на повреждение ДНК и раке.

Füllgrabe, J., Hajji, N. & Joseph, B. Раскрытие кода смерти: модификации гистонов, связанные с апоптозом.

Грир, Э. Л. и Ши, Ю. Метилирование гистона: динамическая марка в здоровье, болезни и наследственности.

Kim, J. & Kim, H. Рекрутирование и биологические последствия модификации гистона H3K27me3 и H3K9me3. ILAR J. 53(3-4):232-9 (2012).

Kschonsak, M. & Haering, C. H. Формирование митотических хромосом: от классических концепций до молекулярных механизмов.

Лоундес, Н. Ф. и Тох, Г. В. Л. Ремонт ДНК: важность фосфорилирующего гистона H2AX.

Пинто, Д. М. С. & Флаус, А. Структура и функция гистона H2AX. Подклетка. Биохимия. 50, 55 ≈ 78 (2010).

Россетто, Д., Аввакумов, Н. и Коте, Дж. Фосфорилирование гистона: модификация хроматина, участвующая в различных ядерных событиях.

Рот, С. Ю., Дено, Дж. М. & Аллис, С. Д. Хистоновые ацетилтрансферазы.

Рутенбург, А.Д., Ли, Х., Таверна, С.Д., Патель, Д.Д. и Эллис, С.Д. Многоцелевое взаимодействие модификаций хроматина посредством связанных модулей связывания. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8, (2007)

Voigt, P., Tee, W.W. и Reinberg, D. Двойной взгляд на бивалентные промоторы.